DIRECT FRAGMENTATION DNA TEST

Wah, dari judulnya saja cukup membingungkan. Apa itu direct fragmentation DNA test?

Saat ini, paparan toksin di lingkungan bumi semakin tinggi. Paparan polusi bahan kimia di udara, air, tanah kian tinggi. Penggunaan pestisida dan pupuk non-organik meskipun berusaha dibatasi tapi masih tetap meresahkan. Belum lagi paparan makanan fast food dan rokok yang memiliki imbas pada kesehatan manusia. Semua faktor di atas diduga memiliki peran dalam proses kerusakan DNA. Tapi bagaimana bisa?

Figure 1 Mekanisme terjadinya kerusakan DNA pada sperma [ sumber: http://www.scielo.br/img/revistas/ibju/v33n5/a02f02.gif ]

Figure 1 Mekanisme terjadinya kerusakan DNA pada sperma
[ sumber: http://www.scielo.br/img/revistas/ibju/v33n5/a02f02.gif ]

Paparan toksin yang sering tidak kita sadari ini ternyata memicu ROS (Reactive Oxygen Species). ROS inilah yang menyebabkan terjadinya fragmentasi pada DNA kita. Pada bidang reproduksi, kerusakan DNA biasanya terjadi pada sperma. DNA sperma memegang peranan penting dalam menjalankan fungsi regenerasi. Kerusakan DNA sperma selain disebabkan faktor lingkungan juga bisa disebabkan faktor lain seperti trauma dan suhu testis yang ekstrim (panas maupun dingin).

Pada beberapa kasus reproduksi, infertilitas maupun keguguran berulang, kemungkinan besar disebabkan adanya kerusakan pada DNA sperma (DNA fragmentation). Meskipun beberapa literatur tidak mendukung, tetapi pemeriksaan fragmentasi DNA sebagai petanda kualitas sperma masih dapat dilakukan, meski bukan merupakan pemeriksaan rutin.

Figure 3 ICAD (inhibitor CAD; dikenal DFF45) sebagai chaperone untuk CAD (caspase-activated DNase; dikenal DFF40 (DNA fragmentation factor, 40kDa) dan CPAN (caspase-activated nuclease)  [ sumber: http://www.nature.com/nrm/journal/v6/n9/images/nrm1715-f5.jpg ]

Figure 3 ICAD (inhibitor CAD; dikenal DFF45) sebagai chaperone untuk CAD (caspase-activated DNase; dikenal DFF40 (DNA fragmentation factor, 40kDa) dan CPAN (caspase-activated nuclease)
[ sumber: http://www.nature.com/nrm/journal/v6/n9/images/nrm1715-f5.jpg ]

Presentasi sperma dengan fragmentasi DNA disebut skor DNA Fragmentation Index (DFI). Skor ini mengindikasikan kemungkinan sperma berkontribusi terhadap masalah infertilitas. Pembagian skornya adalah sebagai berikut:

  • ≤ 15% DFI             → potensial fertilitas baik
  • 15%-25% DFI      → potensial fertilitas sedang
  • ≥ 25% DFI             → potensial fertilitas buruk

COMET ASSAY

Comet assay memiliki nama resmi Single Cell Gel Electrophoresis Assay adalah sebuah teknik yang memiliki sensitifitas tinggi untuk mendeteksi kerusakan DNA pada sel uekariotik. Comet assay pertama kali dikembangkan oleh Östling & Johansson pada 1984 dan kemudian dimodifikasi oleh Singh et al. pada 1988. Sejak itu, teknik ini semakin popular dan dijadikan standar dalam evaluasi kerusakan DNA, evaluasi terapi DNA, uji biomonitor dan genotoksisitas. Kata comet merujuk pada pola migrasi DNA yang terbentuk pada elektroforesis yang sering menyerupai komet.

PREMIS

  • DNA yang rusak → DNA yang terfragmentasi.
  • DNA rusak semakin banyak → fragmen DNA semakin banyak.
  • Fragmen DNA kecil → bergerak lebih jauh dan cepat.

Figure 4 DNA sehat sebagai kepala komet, DNA rusak sebaiak ekor komet [ sumber: http://www.rndsystems.com/resources/images/6326.gif ]

Figure 4 DNA sehat sebagai kepala komet, DNA rusak sebaiak ekor komet
[ sumber: http://www.rndsystems.com/resources/images/6326.gif ]

Konsep utama dari comet assay adalah DNA yang sehat merupakan rangkaian yang terikat kuat dengan matriks protein inti. Ketika DNA rusak, rangkaian ini menjadi lemah. Rantai DNA kehilangan kekuatan strukturnya dan ketika berada di bawah pengaruh medan elektrik, fragmen DNA yang bermuatan negative akan menuju anoda yang bermuatan positif. DNA yang tidak rusak, tetap utuh dengan kekuatan struktur DNA, dan terlalu berat untuk bergerak mengikuti pengaruh medan elektrik, sedangkan fragmen DNA yang rusak, semakin kecil fragmen, semakin cepat dan jauh bergerak menuju anoda.

Pada gambar di atas menunjukkan struktur yang menyerupai komet dengan kepala bulat yang menunjukkan DNA yang tidak rusak yang tetap berada di tempatnya, dan ekor yang merupakan DNA yang rusak. Semakin terang dan panjang ekor komet, menunjukkan semakin besar kerusakan DNA yang terjadi.

Comet assay adalah sebuah teknik yang baik untuk mendeteksi kerusakan DNA dan mengkuantitas kerusakan DNA. Kerusakan DNA bisa terjadi pada rantai tunggal maupun rantai ganda DNA. Untuk membedakan keduanya dapat menggunakan teknik alkali. Pada kondisi netral (pH 8-9), biasanya lebih sensitif mendeteksi kerusakan DNA rantai ganda. Sedangkan pada kondisi alkali (pH ≥13) lebih sensitive mendeteksi kerusakan DNA rantai tunggal.

Comet assay dapat menjadi pilihan pada kasus oligozoospermia karena comet assay membutuhkan sejumlah kecil sel (biasanya sekitar 100 sel sperma).

PROTOKOL

ENKAPSULASI

Sel sampel baik berasal dari kultur maupun langsung dari subjek ditanam pada media agarose pada 37°C. suspense ini diletakkan pada kaca objek khusus dengan kaca penutup dan dibiarkan pada suhu 4°C. setelah terbentuk lapisan tipis agarose, kaca penutup bisa diambil.

Agarose membentuk matriks serat karbohidrat yang berfungsi enkapsulasi sel. Agarose juga berperan sebagai materi netral-osmotik sehingga larutan yang dibutuhkan bisa menembus agarose dan mengenai sel sampel.

Untuk kalibrasi kerusakan DNA biasanya menggunakan paparan hydrogen peroksida.

Figure 7 Prosedur comet assay [ sumber: http://www.amsbio.com/images/featureareas/Comet-procedure.jpg ]

Figure 6 Prosedur comet assay
[ sumber: http://www.amsbio.com/images/featureareas/Comet-procedure.jpg ]

LISIS

Kaca objek ini lantas direndam dalam larutan yang melisiskan sel. Larutan yang biasanya digunakan dalam comet assay adalah larutan tinggi garam dan deterjen (Triton X-100). pH larutan ini disesuaikan dengan tujuan comet assay yang ingin dikerjakan, apakah teknik netral atau teknik alkali, disesuaikan dengan jenis kerusakan DNA yang ingin dideteksi.

Larutan garam akan merusak protein dan kekuatan ikatan sel, begitu juga dengan RNA. Dengan proses lisis ini, sel dihancurkan. Semua protein, RNA, membrane, sitoplasma dan nukleoplasma akan rusak dan berdifusi menuju agarose. Hanya DNA yang akan tertinggal di rongga agarose dimana sel utuh tadi berada. Struktur ini disebut nucleoid (struktur konsentrasi DNA).

ELEKTROFORESIS

Setelah sel lisis (1-2 jam pada 4°C) maka kaca objek dicuci di air untuk menghilangkan garam dan sisa sel yang terlarut. Kaca objek ini lantas direndam di larutan kedua, larutan elektroforesis. pH larutan ini disesuaikan dengan teknik dan tujuan pemeriksaan.

Kaca objek dibiarkan selama kurang lebih 20 menit dan medan elektrik dinyalakan selama 20 menit. Setelah itu, kaca objek dinetralisasi menjadi pH 7, diberi pewarnaan fluoresen khusus DNA dan dianalisis dengan mikroskop.

INTERPRETASI

Saat ini telah dibuat perangkat luna yang memudahkan interpretasi hasil dari comet assay. Tetapi beberapa metode penghitungan manual dapat dilakukan. Diantaranya menghitung jumlah DNA yang rusak.

Figure 8 Interpretasi kerusakan DNA

Figure 7 Interpretasi kerusakan DNA

TUNEL ASSAY

TUNEL assay merupakan akronim dari Terminal-Deoxynucleotidyl-Transferase (TDT) mediated of labeled (X) deoxyuridine triphosphate nucleotides (X-dUTP) Nick-End-Labeling. Metode ini adapat menggunakan mikroskop biasa, mikroskop fluoresen, maupun flowcytometry. TUNEL assay dapat mendeteksi fragmentasi DNA pada rantai tunggal maupun ganda yang disebabkan aktifitas endonuclease endogen selama proses apoptosis.

Figure 8 TUNEL assay menggunakan bromin dan kelompok alkyne  [ sumber: http://www.jenabioscience.com/images/8bd31f7cad/apoptosis.gif ]

Figure 8 TUNEL assay menggunakan bromin dan kelompok alkyne
[ sumber: http://www.jenabioscience.com/images/8bd31f7cad/apoptosis.gif ]

Prinsip kerjanya adalah TdT memberi label pada DNA ujung 3’-hydroxyl. Setelah TdT menempel, penambahan dUTP yang dilengkapi dengan petanda (biasanya fluoresen). TUNEL assay mendeteksi DNA yang rusak secara langsung, tanpa proses denaturasi (asidisasi maupun alkalinisasi). Proses yang harus dilalui adalah fiksasi dan meningkatkan permeabilitas sel, inkubasi dengan pemberian label DNA, dan pengecatan serta yang terakhir pendeteksian. Untuk metode flowcytometry menggunakan petanda fluoresen. Untuk metode kolorimetri, biotinylated-DNA-fragment dapat dideteksi menggunakan streptavidin-conjugated horseradish peroxidase. Flowcytometry meningkatkan akurasi dan sensitifitas pengukuran karena menggunakan secara otomatis mengkalkulasi berapa jumlah DNA yang rusak.

TUNEL assay ini sangat bergantung pada efisiensi dari modifikasi label yang melekat pada dUTP. Beberapa petanda fluoresen yang telah teruji sesuai dengan TdT adalah biotilylated-dUTP dan digoxigenylated-dUTP. Tetapi ada beberapa petanda yang berukuran lebih kecil seperti bromin (BrdUTP) atau kelompok alkyne (EdUTP) menunjukkan efisiensi yang lebih baik dalam hal pelekatan dengan TdT sehingga sensitifitas TUNEL assay lebih tinggi.

 
Dicky Faizal
Mahasiswa PPDS Andrologi